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【概要】
沙丁胺醇（salbutamol，SAL）是一种肾上腺受体激动剂即神经兴奋剂，在临床上用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病，因为该药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。人食用了含有沙丁胺醇的食品可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对人的健康极有危害。现已被明令禁止用于养殖业。
HPLC或GC-MS一直用作检测β兴奋剂的方法，但是其前处理步骤费用昂贵。酶联免疫检测试剂盒则可经济、快速地检测尿，肌肉，肝脏及饲料中的沙丁胺醇。
【适用范围及检测限】
可定性、定量检测尿液，血清/血浆，肝脏，肾脏，肉类和组织等样本中的沙丁胺醇的含量。
检测限为：0.1ppb
【试验原理】
本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被沙丁胺醇抗体，样本中残留的沙丁胺醇和酶标沙丁胺醇抗原竞争微孔条上预包被的抗体，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物沙丁胺醇的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中沙丁胺醇的含量。
【试剂盒组成】
1. 96孔酶标板×1块
2. 标准液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb，8.1ppb
3. 酶标物 1瓶 …………………………………………… 6ml
4. 显色液1瓶 ……………………………………… 12ml
5. 终止液 ………………………………………6ml
6. 浓缩洗涤液 （10×） ………………………………… 40ml
7. 浓缩样品稀释液（2×） ……………………………… 40ml
【需要而未提供的设备及试剂】
设备：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅振荡器
┅┅涡旋仪
┅┅离心机
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、200ml～1000ml
多道 250ml
┅┅滤纸
试剂：
┅┅甲醇
┅┅氢氧化钠
┅┅庚烷（n-heptane）
┅┅50mM HCL
┅┅50mM磷酸二氢钾缓冲液Ph3.0
┅┅500mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0
┅┅50mM Tris 缓冲液pH8.5
┅┅C18固相提取柱
【试剂配制】
1. 样品稀释液：用去离子水1:1体积比进行稀释，即：1份克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)+1份去离子水。
2. 洗涤工作液：用去离子水按1:9体积比进行稀释，即：1份浓缩洗涤液(10×)+9份去离子水。
3. 1M 氢氧化钠溶液：称取4.0g 氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml。
4. 0.1M 盐酸溶液：量取0.83ml浓盐酸加去离子水定容至100ml。
5. 组织样本提取液：80ml 25%甲醇溶液加入20ml 0.1M 盐酸。
【样本前处理步骤】
（一）尿液
--- 取20mL清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或3000g以上，15℃离心10min直至清亮），暂不使用的样本应冷冻保存。
（二）肉和组织
--- 5g 粉碎的样品与25mL50mM Tris 缓冲液pH8.5混合，振荡0.5小时，匀浆。
--- 加入15mL庚烷（n-heptane）振荡5分钟。
--- 4000g或更高的速度10-15℃离心5分钟。
--- 除去上面的庚烷层及中间的脂肪层。
--- 向匀浆的肉液中加入0.5mL半浓的盐酸，振荡1小时。
--- 称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心管中。
--- 加入4mL500mM磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0），简单的混合后放置4℃至少1.5小时或过夜。
--- 10-15℃以4000转/分或更高速，离心15分钟。分离全部上清液（应该是清亮的），使其升至室温（20-25℃），然后用C18柱纯化。
【检测步骤】
1、测定前须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20～25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
2、操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。不要冷冻。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本70ml到对应的微孔中，加入酶标物30ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应30min。
6、小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300ml/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。
7、加入显色液100ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境反应30min。
8、加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
【结果判定】
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以**个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝B×100%B0B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以沙丁胺醇标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中沙丁胺醇实际量。
【注意事项】
1. 室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3. 每加一种试剂前需将其摇匀。
4. 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5. 不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6. 储存条件：
保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7. 试剂变质的迹象：
发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。
8. 在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为20～30min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到35min（或更长），但不得超过40min。反之，则减短反应时间。
9. 该试剂盒**佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【贮藏条件及保存期】
贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。
保存期：该产品有效期为12个月。
北京康源泰博生物科技有限公司
