阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒

阪崎肠杆菌（Enterobactersakazaii）是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。本公司自主研发的阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒采用实时荧光PCR技术，针对阪崎肠杆菌基因的核酸序列设计特异性引物和探针，通过实时荧光PCR反应对奶粉（乳）制品中的阪崎肠杆菌进行定性检测，灵敏度高，特异性强，能快速检测出奶粉（乳）制品中的阪崎肠杆菌。

检测步骤

1.样本处理

 取100g(ml)样品，加入900ml  的无菌蒸馏水，震荡溶解，与 37度培养15h  左右。移取 1ml转入 10ml 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中， 37 度震荡培养约5h        。  

2.样本DNA提取        

 取1.5ml增菌液，采用商品化的细菌DNA 提取试剂盒，按照试剂盒说明提取样本 DNA。对提取的DNA进行浓度测定， DNA溶液的 OD260/280比值在 1.7-2.0 为**佳。

 3.试剂准备 

 冰上解冻反应试剂，反应液保持避光，解冻后将反应液混匀并简短离心，按每管20ul的量分装至PCR 管中。  

 4.PCR加样

 每管中加入DNA样本5ul ，盖好管盖，简短离心，同时做阳性对照，阴性对照和空白对照（以水代替样本 DNA）。        

5.PCR扩增

将加好的样品放置在PCR 仪中，荧光通道选择FAM ， PCR 反应参数见表，使用不同的PCR仪，反应参数可适当调整。

6.结果分析 

 基线和阈值的设置：基线范围设置在3-15个循环，阈值设置在基线刚好超过阴性对照扩增曲线的**高点。

质量控制：阳性对照CT≤30，有S        型扩增曲线；阴性对照无CT值，扩增曲线为直线；空白对照无CT值，扩增曲线为直线。若出现任一结果不正常，需重做实验。

结果判定

1.检测样品无CT值，曲线为直线或无S型扩增曲线，判定结果为阴性。  

2.检测样品CT≤35，出现S型扩增曲线，判定结果为阳性。

3.检测样品35﹤CT ﹤40并有S型扩增曲线，需适当增加DNA模板量后重新做实时荧光PCR检测，再次检测结果CT值仍处于35和40之间，并且有S 型扩增曲线，判定结果为阳性，否则判定为阴性。

检出限    4cfu/ml(g) 

包装规格    40次/盒 

注意事项

   1.初次使用前请仔细阅读说明书，并严格按照说明书进行操作。

   2.实验操作要严格分区，防止污染。

   3.反应液反复冻融会降低灵敏度，建议分管保存。

   4.本试剂盒仅供定性筛查用。

   5.筛选阳性的样本需按国标法进行确证。 

储藏条件与有效期

   本试剂盒保存于-20℃，有效期 12个月。